技术和方法
  • 衣藻人工microRNA基因敲降技术
  • 衣藻随机插入失活突变体库

中国科学院水生生物研究所藻类细胞生物学实验室

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    衣藻人工microRNA基因敲降技术


         为了研究衣藻基因的生物学功能,除了通过筛选文库获得表型稳定的缺失突变体,我们还能借助siRNA和人工 miRNA技术对目的基因进行敲降,尝试观察基因表达下调后的表型。本课题组利用报告基因荧光素酶(Luciferase)融合人工 miRNA,开发了一套简便高效的衣藻miRNA基因敲降技术。

    该miRNA基因敲降技术具有以下特点:

    1. 选用衣藻内源miRNA序列做为人工miRNA搭建骨架,采取8条引物退火的方法,24小时即可获得人工miRNA表达载体。

    2. 利用PsaD启动子,RbcS2内含子等转录元件,强效驱动人工miRNA与Luciferase的融合表达。

    3. 利用酶标仪或者Photo counting相机成像技术检测Luciferase活性,快速筛选人工miRNA高表达藻株,从而获得最好的敲降效果。

    4. 选用诱导型启动子Nit1启动子构建人工miRNA表达载体,实现衣藻细胞内目的基因的条件性敲降。

      利用该敲降技术,本课题组成功敲降了叶绿体相关基因VIPP1,鞭毛解聚基因CDPK3以及微泡(Ectosome)释放相关ESCRT基因VPS4和PDCD6,目的基因转录水平可敲降至野生型的22%,相关蛋白表达下调至野生型的3%。相关成果发表在Plant Journal和Current Biology上。

    文库构建的详细资料请参考Plant Journal原文:

    http://onlinelibrary.wiley.com/wol1/doi/10.1111/tpj.12606/abstract

    利用该敲降技术发表的相关工作:

    Long, H. F. Zhang, N. Xu, G. Liu, D.R. Diener, J.L. Rosenbaum, and K. Huang. Comparative Analysis of Ciliary Membranes and Ectosomes. Current Biology. 2016, 26(24): 3327-3335

    http://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(16)31140-X






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    衣藻随机插入失活突变体库


      莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)作为单细胞真核绿藻,是研究鞭毛/纤毛,叶绿体以及生物能源的重要模式生物,工业上衣藻还能用于油脂,抗体以及药物的生产和提取。与小鼠,斑马鱼,线虫以及水稻等模式生物类似,化学/物理诱变,遗传转化,细胞器纯化,荧光蛋白标记等分子遗传,生化和细胞生物学技术被广泛应用于衣藻研究。然而,衣藻研究却一直缺少高效的基因敲除技术。为了能及时获得特定基因的衣藻突变体,本课题组通过优化亲本藻株、突变体保存方法与插入位点鉴定方法等技术细节,构建并维护了包含15万株衣藻突变体的随机插入失活突变体库。假设每1 kb基因组序列至少包含1个插入片段,理论上该文库能够覆盖整个衣藻基因组(111 Mb), 每个基因有5个相应的插入突变体。。

      该文库不仅用于筛选特定基因的缺失突变体,还应用于筛选鞭毛和油滴缺陷突变体。根据基因序列设计基因特异PCR引物和插入片段设计的通用引物,我们利用定向PCR成功筛选获得28个衣藻突变体,对应22个与鞭毛组装、ESCRT复合体、淀粉合成、脂质合成、钙信号调控和铁元素代谢相关的基因。同时,我们还通过表型观察获得967株表毛缺陷型突变体与929株油滴合成突变体。该突变体文库将为衣藻领域相关理论与应用研究提供强有力的技术支撑。相关成果发表在Plant Methods和Nature Communications上。

      文库构建的详细资料请参考Plant Methods原文:https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-017-0183-5

      利用该文库突变体发表的相关工作:

    Hochmal, A.K., K. Zinzius, R. Charoenwattanasatien, P. Gabelein, R. Mutoh, H. Tanaka, S. Schulze, G. Liu, M. Scholz, A. Nordhues, J.N. Offenborn, D. Petroutsos, G. Finazzi, C. Fufezan, K. Huang, G. Kurisu, and M. Hippler. 2016. Calredoxin represents a novel type of calcium-dependent sensor-responder connected to redox regulation in the chloroplast. Nat Commun, 2016, 7: 11847.

    http://www.nature.com/ncomms/2016/160614/ncomms11847/full/ncomms11847.html


      突变体筛选流程:A. 莱茵衣藻ift46-1 IFT46::YFP 作为建库电转化的亲本藻株,巴龙霉素抗性基因aphVIII作为筛选标记,通过电转化获得衣藻转化子单克隆。 B1. 48个转化子作为一个单位,分别划线并保存于平板上。 B2. 30个平板(共1440个单克隆)作为一个突变体超级文库,将1440个转化子接种至直径为15 cm的平板上,培养3天。B3. 将藻细胞重悬至TAP培养基内,培养4天,并提取基因组保存为超级文库。B4-B5. 以突变体超级文库基因组为PCR模板,利用插入片段基因通用引物及目的基因特异性引物,进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳后,分离特异性条带,并测序鉴定,将目标突变体定位至突变体超级文库。B6-B9 选择目标突变体对应的超级文库,以96个突变体作为一个子库,接种于一个直径为9 cm的平板上,提取子库基因组,筛选阳性子库。将阳性子库中的96个转化子接种至96孔板内,以十字交叉法的方式进行藻落PCR,定位目标突变体。C1-C4. 将衣藻转化子接种到缺氮TAP培养液,在解剖镜下鉴定运动功能缺陷的突变体,进一步在Confocal下筛选IFT法定位至basal body的突变体,提取突变体基因组,利用RESDA-PCR定位插入位点。D1-D4. 在缺氮TAP培养液中加入尼罗红荧光染料,利用倒置荧光显微镜筛选油滴信号显著减少的突变体,进一步用Confocal确认,并利用薄层层析(TLC-assay)鉴定油脂含量变化。